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Tn-seq法筛选高毒力肺炎克雷伯菌新毒力基因
编辑人员丨1周前
目的:建立转座子突变文库,筛选高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKp)的新毒力基因。 方法:构建转座子突变文库,血清处理,通过转座子测序(transposon sequencing, Tn-seq)比较分析血清处理前后各基因突变株在文库中丰度变化,并对筛选出的基因进行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释和富集分析。结果:以处理后丰度低于初始丰度20%为界,共筛选出405个基因,其中351个基因在HS11286、NJST258_1、NTUH-K2044和RJF293等4株参考菌株中保守存在,占86.7%,10个基因为NTUH-K2044和RJF293两株高毒力株共有而低毒力株HS11286和NJST258_1缺失;荚膜多糖基因簇中基因如糖基转移酶基因 wzy、聚集蛋白基因 wzi、荚膜转运蛋白基因 wza等突变株在血清处理后不能检出,气杆菌素、沙门氏菌素等铁载体基因簇在各文库中的丰度变化不超过1倍;KEGG注释结果显示,注释最多的基因为参与氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢、碳水化合物代谢等。 结论:Tn-seq是功能基因筛选的可靠方法,本研究成功筛选出405个hvKp的候选新毒力基因,为后续深入研究hvKp的新毒力基因功能和调控机制提供实验依据。
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编辑人员丨1周前
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卵巢上皮性癌耐药相关ceRNA的生物信息学分析及临床验证
编辑人员丨1周前
目的:通过生物信息学方法挖掘与卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药相关的可作为竞争性内源RNA(ceRNA)的长链非编码RNA(lncRNA),并进行临床验证。方法:(1)挖掘与卵巢癌相关的lncRNA并构建ceRNA调控网络:综合应用文本挖掘、数据预测和网络构建等生物信息学方法,建立与卵巢癌耐药相关的潜在ceRNA调控网络,即lncRNA-微小RNA(miRNA)-mRNA调控网络。(2)临床验证:收集2008年6月至2016年10月在广西医科大学附属肿瘤医院行肿瘤细胞减灭术的卵巢癌患者共95例,其中铂类药物耐药患者54例(耐药组),铂类药物敏感患者41例(敏感组),采用实时荧光定量PCR技术检测两组卵巢癌组织中lncRNA的表达,分析lncRNA表达对卵巢癌患者预后的影响,并分析lncRNA表达对卵巢癌耐药的诊断效能。结果:(1)文本挖掘初步筛选出25个与卵巢癌发生、发展相关的差异表达lncRNA;亚细胞定位分析发现,有8个lncRNA存在于细胞质中;通过进一步数据挖掘、共线文献分析,预测其中的两个lncRNA分子[即生长阻滞特异性转录因子5(GAS5)和HOXC基因座转录因子(HOTAIR)]可作为关键ceRNA分子;构建ceRNA调控网络,GAS5与miRNA(即miR139-5p、miR-24-3p)及mRNA[即乳腺癌易感基因1(BRCA1)、肿瘤蛋白p53(TP53)、表皮生长因子受体(EGFR)、B细胞淋巴瘤2基因(BCL-2)、细胞癌基因(FOS)、H-Ras蛋白(HRAS)]组成ceRNA调控网络,HOTAIR与miRNA(即miR-30a-5p)及mRNA[即磷酸肌醇3激酶调控亚基2(PIK3R2)、TP53、丝蛋白(VIM)]组成ceRNA调控网络。(2)实时荧光定量PCR技术检测显示,与敏感组(设为1.0)比较,耐药组卵巢癌组织中GAS5的表达水平为2.1±1.6,HOTAIR的表达水平为3.5±1.9,两组分别比较,差异均有统计学意义( P=0.011, P<0.01);Cox回归模型多因素分析显示,GAS5、HOTAIR表达为影响卵巢癌患者无病进展生存率和总生存率的独立危险因素( P<0.05)。GAS5与HOTAIR联合检测诊断卵巢癌的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)为0.871,显著高于GAS5单独检测和HOTAIR单独检测(AUC分别为0.678、0.863),分别比较,差异均有统计学意义( P均<0.05)。 结论:GAS5与HOTAIR高表达与卵巢癌耐药密切相关,可作为卵巢癌化疗反应的潜在预测指标;GAS5与HOTAIR联合检测对卵巢癌患者具有一定的诊断效能。这种利用ceRNA调控网络预测关键分子的方法,为卵巢癌的诊断和治疗提供了新的思路。
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编辑人员丨1周前
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口蹄疫病毒样颗粒诱导表达型载体的构建及其BHK-21细胞池的筛获
编辑人员丨1个月前
瞬时表达是目前利用哺乳动物细胞表达口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白的主流方法.为实现染色体稳定表达 FMDV 衣壳蛋白并高效组装出病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究构建了piggyBac(PB)转座-组成型表达、PB转座-四环素(tetracycline,Tet)诱导型表达两套质粒.利用荧光蛋白标记技术,验证了质粒的功能.通过抗生素筛选得到了组成型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21 细胞池(C-WT、C-L127P)和诱导型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21 细胞池(I-WT、I-L127P).荧光观察和PCR检测证明了绿色荧光蛋白、3C蛋白酶、反向四环素转录激活因子等基因的稳定整合.Western blotting、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验证明了细胞池I-L127P具有更强的衣壳蛋白和VLPs生产能力.本研究首次实现了哺乳动物细胞染色体诱导表达 FMDV 衣壳蛋白,有助于推动哺乳动物生产 FMDV VLPs疫苗的技术工艺,也为构建其他蛋白的哺乳动物细胞诱导型表达系统提供了参考.
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编辑人员丨1个月前
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单细胞染色质转座酶可及性高通量测序技术及其应用
编辑人员丨2024/2/3
单细胞染色质转座酶可及性的高通量测序(single-cell assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing,scATAC-seq)是利用转座酶研究单细胞染色质开放性的高通量测序技术,对于研究全基因组的表观遗传调控具有重要的意义.可从多个维度揭示有关染色质"组装"的重要信息,从而映射出细胞中的转录因子调控蛋白的结合区域和核小体定位等信息.目前,scATAC-seq技术已在生物和医学领域得到广泛应用,主要用于开放染色质图谱的绘制、细胞分化和发育、疾病致病机制以及肿瘤微环境的研究.本文阐述了scATAC-seq技术研究单细胞染色质开放区域的发展概况、数据分析和相关应用,期望对单细胞全基因组水平的染色质开放区域研究、顺式调控元件鉴定以及遗传调控网络的解析等提供借鉴,以期为今后更好的在生命科学研究中起到推动作用.
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编辑人员丨2024/2/3
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假单胞菌属中新型IncpGRT1质粒的遗传特性及其潜在传播风险
编辑人员丨2023/10/28
目的 分析来自假单胞菌的IncpGRT1质粒的基因组结构和遗传特征,阐明其潜在的传播风险.方法 对临床分离菌株15420352进行分纯和保种后提取基因组DNA,随后进行全基因组测序.测序获得了质粒p420352-strA的完整序列,并对其进行质粒型别判断.对所有5个已测序的同型别质粒进行了骨架区和外源插入区的精细注释,其中包括本研究中测序的1个质粒p420352-strA和来自GenBank的4个质粒.主要通过RAST、Plasmidfinder、Blast、ResFinder和IS-finder等核定质粒的ORFs并筛查耐药毒力等相关的关键基因.结果 5个质粒被划分为新的IncpGRT1型质粒.它们均存在保守的IncpGRT1骨架标记,除主复制子repAIncpGRT1外,还筛查到这些质粒均获取了一个辅复制子.5个IncpGRT1质粒携带了至少3个不同的主要外源插入区:srp区域、msr区域、Tn5053家族转座子.这些质粒中共发现3个已知的涉及2类抗生素耐药和重金属抗性的基因:strA、strB、mer.并发现在这些质粒里携带了至少1种毒力因子msr和5种关键的转运蛋白srp、emrE、mod、phn及lpt.结论 IncpGRT1型质粒已经成为一些耐药基因及毒力基因在假单胞菌属中积累和传播的重要载体,并提高了菌株的环境适应性.
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编辑人员丨2023/10/28
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发育型内皮基因座-1作用下氧化型低密度脂蛋白对巨噬细胞分泌TNF-α、MIP-1α及MIP-2的影响
编辑人员丨2023/9/30
目的 探讨发育型内皮基因座-1(DEL-1)作用下氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)对巨噬细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、巨噬细胞炎性蛋白 1α(MIP-1α)及巨噬细胞炎性蛋白 2(MIP-2)表达的影响.方法 体外培养人单核-巨噬细胞系THP-1 细胞株至对数生长期,分为佛波脂(PMA)组(PMA诱导为贴壁的巨噬细胞)、OX-LDL组(OX-LDL诱导为泡沫细胞)、si-NC 组(50 nmol/L siRNA-NC 的小干扰转染细胞)及小干扰 RNA-DEL-1(siRNA-DEL-1)组(50 nmol/L siRNA-DEL-1 转染细胞),采用油红O染色鉴定泡沫细模型、并检测各组细胞中脂质积累,采用免疫荧光技术检测各组细胞中DEL-1 的表达,采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测各组细胞中 DEL-1、MIP-1α、MIP-2 及 TNF-α信使 RNA(mRNA)和蛋白的表达;采用 Pearson 相关系数分析DEL-1 蛋白表达与上述炎性因子的相关性.结果 油红O染色结果显示,靶向敲低DEL-1 泡沫细胞胞质内脂质积累减少;免疫荧光、Western blot及RT-PCR结果显示,OX-LDL组、siRNA-NC组细胞中DEL-1 及下游炎性因子MIP-1α、MIP-2 及TNF-α的蛋白及mRNA表达较PMA组上调(P<0.05),siRNADEL-1 组细胞中上述因子表达较OX-LDL组及siRNANC组下调(P<0.05).结论 DEL-1 介导了OX-LDL源性泡沫细胞分泌MIP-1α、MIP-2 及TNF-α,可能参与了动脉粥样硬化(AS)的病变过程.
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编辑人员丨2023/9/30
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果蝇杂种劣育与P因子转座调控
编辑人员丨2023/9/30
果蝇Drosophila杂种劣育(hybrid dysgenesis)指某些品系果蝇间杂交,子代出现诸如卵巢发育不全、分离比异常、雄性个体减数分裂出现重组、高突变率、高频率染色体畸变甚至不育等异常现象.该现象可由多种转座因子(transposable element,TE)频繁转座引起,包括:P因子、Ⅰ因子、hobo因子、Penelope因子、Paris因子和Helena因子等.其中P因子是首个确定DNA序列的真核生物转座子,也是研究得最为充分的动物TE之一,已被开发成基因工程工具,在果蝇转基因研究中发挥重要作用.基因组中携带P因子的果蝇为父系品系(paternal strain),即P品系,无P因子的果蝇为母系品系(maternal strain),即M品系.M雌xP雄杂交子代,在繁殖过程中出现杂种劣育现象,而P雌×M雄、M雌×M雄以及P雌xP雄交配组合的后代都是正常的.近20年来,P因子调控机制研究取得重大进展,在原有阻遏蛋白机制外,又发现了与PIWI蛋白相互作用的RNA[P-element-induced wimpy testis(PIWI)-interacting RNA,piRNA]机制.阻遏蛋白机制基于 P 因子转座酶4个外显子间的3个内含子转录后剪切方式:如果3个内含子均被剪切,则产生的mRNA包含4个外显子,翻译为87 kD的转座酶,促进P因子转座;如果仅前2个内含子被剪切,则产生的mRNA在第3个内含子区段所含终止密码子处提前终止翻译,产生66 kD的阻遏蛋白,阻止P因子转座.近年发现的piRNA机制是更为普遍的TE调控机制,该机制类似细菌中发现的CRISPR来源的RNA(CRISPR-derived RNA,crRNA)机制,编码piRNA的基因也成簇排列,称为piRNA基因簇.piRNA基因簇转录出单链RNA前体分子,剪切为23~32 nt的piRNA,随即与PIWI蛋白结合形成复合体,并通过两个途径发挥作用:一是降解与piRNA序列互补的靶mRNA,发挥转录后沉默作用;另一是进入细胞核,指导P因子或piRNA基因簇序列的表观遗传修饰,发挥对P因子的转录抑制作用,和对piRNA基因簇的转录激活作用.研究发现,阻遏蛋白机制和piRNA机制在P因子转座调控中均发挥作用.本文可为果蝇杂种劣育现象的教学和科研工作提供帮助.
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编辑人员丨2023/9/30
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浙贝母叶斑病病原真菌的分子鉴定及杀菌剂筛选
编辑人员丨2023/9/23
[目的]明确浙贝母叶斑病的致病菌种类,并筛选有效杀菌剂.[方法]采用病组织分离法,从浙贝母叶斑病病株中分离纯化真菌,以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增基因组DNA的内源转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)、翻译延伸因子-1α(translation elongation factor-1α,TEF-1α)和微管蛋白基因(tubulin gene,TUB)并双向测序,经 DNAMAN 9.0软件拼接后利用基本局部对齐搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)进行分析.采用邻接法构建系统发育树以鉴定真菌种类,采用菌饼接种寄主植物和组培苗的柯赫氏法检测致病性,以生长速率法和抑菌圈法室内筛选病原真菌的有效杀菌剂.[结果]从浙贝母叶斑病病株中分离纯化获得1种间座壳属(Diaporthe)真菌.分离物的ITS、TEF-1α和TUB扩增片段与GenBank 中 Diaporthe eres(无性型为 Phomopsis oblonga,P.oblonga)相应片段的同源性分别为 100%、99.73%和 96.95%(登录号:LC342971、MW804672、MT561360).在间座壳属中,分离物与P.oblonga的亲缘关系最近.该菌株接种浙贝母植株和组培苗后诱发浙贝母叶斑病.吡唑醚菌酯、咯菌腈、异菌脲、苯醚甲环唑、腈菌唑、咪鲜胺对该真菌的半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)分别为0.174、0.084、1.092、0.041、0.619和0.004μg·mL-1;6种杀菌剂对P.obloniga孢子萌发的抑制效果为咪鲜胺>吡唑醚菌酯>苯醚甲环唑>腈菌唑>咯菌腈和异菌脲.[结论]本研究证实,P.oblonga是浙贝母叶斑病病原真菌,咪鲜胺和苯醚甲环唑是防治浙贝母叶斑病的有效杀菌剂.
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编辑人员丨2023/9/23
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金鱼草RADIALIS-like1基因克隆与功能研究
编辑人员丨2023/8/12
MYB是植物中最大的转录因子家族之一,其中R3-MYB转录因子RADIALIS(RAD)在金鱼草(Antirrhinum majus)花发育过程中具有十分重要的作用.本研究对金鱼草基因组进行分析,发现1个与RAD结构相似的R3-MYB基因,将其命名为Am RADIALIS-like 1(Am RADL1).进一步通过生物信息学预测基因功能,利用q RT-PCR分析Am RADL1在野生型金鱼草不同组织器官中的相对表达量,对过表达Am RADL1的转基因金鱼草进行形态学观察和组织学染色分析.结果表明,Am RADL1基因开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为306 bp,编码101个氨基酸,具有典型的SANT结构域,C末端含有CREB motif,与番茄(Solanum lycopersicum)Sl FSM1同源性较高.q RT-PCR结果表明,Am RADL1在根、茎、叶和花中均有表达,其中在花中表达量较高;进一步分析其在不同花器官中的表达量差异,发现Am RADL1在心皮中表达最高.转基因金鱼草植株的组织学染色分析结果显示,与野生型相比,转基因植株的心皮细胞大小没有明显的变化,但心皮中胎座区域变小,细胞数目减少.综上所述,Am RADL1可能参与调控心皮发育,但在心皮中的具体作用机制还有待进一步研究.
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编辑人员丨2023/8/12
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BHD综合征与自发性气胸关系的研究进展
编辑人员丨2023/8/6
一、BHD综合征和FLCN基因信号传导Birt-Hogg-Dube'( BHD)综合征是一种罕见的常染色体显性遗传性皮肤病,1975 年和1977 年首次被发现[ 1-2 ]. 1977年,Birt等人研究发现,家族患有遗传性常染色体显性模式中的纤维性滤泡性皮肤肿瘤. 后来被命名为Birt-Hogg-Dubé综合征[1]. Birt-Hogg-Dublos综合征主要特征表现为多发皮肤纤维囊腺瘤,多发性肺囊肿,反复自发性气胸,肾肿瘤等[ 1 ]. 进一步研究发现, BHD综合征由FLCN基因突变引起[3]. Nickerson 等人[3]首次描述了17p11染色体上该基因的易感基因座. 即为FLCN基因.FLCN基因位于染色体17 p11.2 上[ 4 ]. 由14 个外显子组成,编码一种称为卵泡素的64 kDa 蛋白,没有特征功能结构域. 研究发现,FLCN编码两种FL-CN结合蛋白,即为FNIP1 和FNIP2 ,与5α-AMP激活的蛋白激酶( AMPK )相互作用. AMPK是负调节哺乳动物雷帕霉素靶标( mTOR)的细胞中的重要能量传感器,是细胞生长和增殖的调节枢纽[5-7]. 故推测FLCN可能在细胞能量和生长增殖过程中发挥重要作用. 研究表明, BHD综合征的患者中,肺囊肿细胞中强烈表达磷酸化mTOR 和磷酸化S6 ,在FLCN单倍体不足的条件下,肺囊肿细胞中mTOR信号传导加速,下游分子如S6蛋白和VEGF有助于囊肿的发展[ 8 ]. 最近的研究已经阐明了FLCN在转录因子E3 和转化生长因子β的调节中的抑制活性,其广泛参与肿瘤发生和凋亡[9-10].
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编辑人员丨2023/8/6