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丁苯酞拮抗依托泊苷诱导的血管内皮细胞衰老
编辑人员丨4天前
目的 探讨丁苯酞(3-n-butylphthalide,NBP)对依托泊苷诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endo-thelial cells,HUVEC)衰老的影响.方法 将HUVEC分为空白对照组(内皮细胞培养液)、依托泊苷组(500 nmol/L依托泊苷+二甲基亚砜)、依托泊苷+NBP低浓度组(500 nmol/L依托泊苷+5 μmol/L NBP)、依托泊苷+NBP中浓度组(500 nmol/L依托泊苷+10 μmol/L NBP)、依托泊苷+NBP高浓度组(500 nmol/L依托泊苷+20μmol/L NBP)组.通过衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测衰老细胞比例变化;实时荧光定量聚合酶链反应检测衰老相关分泌表型,如白细胞介素(IL)-8、IL-1β、CXC趋化因子配体1(CXCL1)mRNA水平变化;蛋白质免疫印迹检测衰老相关蛋白P21表达水平变化;免疫荧光染色检测增殖相关蛋白Ki67阳性细胞比例变化.结果 与空白对照组比较,依托泊苷组P21表达、SA-β-gal染色阳性细胞比例、IL-8、IL-1β、CXCL1的mRNA水平均显著升高[1.00±0.00 vs 0.59±0.09、(29.58±4.51)%vs(11.27±1.18)%、2.49±0.11 vs 1.00±0.03、6.32±0.15 vs 1.00±0.03、2.40±0.24 vs 1.00±0.04,P<0.05],Ki67 阳性细胞比例显著降低[(5.95±1.55)%vs(27.38± 7.00)%,P<0.05];与依托泊苷组比较,依托泊苷+NBP低浓度组的SA-β-gal染色阳性细胞比例、P21蛋白表达水平、IL-1β的mRNA水平均降低(P<0.05),Ki67阳性细胞比例增加(P<0.05).结论 NBP对依托泊苷诱导的血管内皮细胞衰老具有拮抗作用.
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编辑人员丨4天前
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白细胞介素-35对慢性心力衰竭患者CD14 +单核细胞的调控作用
编辑人员丨4天前
目的:观察慢性心力衰竭患者白细胞介素-35(IL-35)水平和CD14 +单核细胞功能变化。 方法:连续入组2018年7月至2019年6月在郑州大学第一附属医院心血管内科住院治疗的慢性心力衰竭患者(74例)和健康对照者(29名),清晨空腹采集抗凝外周血20 ml并分离血浆,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血IL-35水平;纯化外周血CD14 +单核细胞,采用实时定量聚合酶链反应法检测CD14 +单核细胞中IL-35受体亚基IL-12Rβ2和gp130 mRNA相对表达量。以IL-35刺激CD14 +单核细胞,与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)直接或间接接触培养,采用ELISA法检测上清中细胞因子和颗粒酶B水平,通过检测乳酸脱氢酶水平计算HUVEC死亡比例。比较慢性心力衰竭组和健康对照组间上述指标的差异。 结果:慢性心力衰竭组的年龄为(59.4±12.1)岁,男性占58.1%(43例);健康对照组的年龄为(53.9±9.8)岁,男性占65.5%(19名);慢性心力衰竭组血浆IL-35水平高于健康对照组[(22.89±7.58)mg/L比(16.42±5.47)mg/L, P<0.001],gp130 mRNA相对表达量亦然(1.07±0.19比0.98±0.15, P=0.022)。慢性心力衰竭组CD14 +单核细胞诱导HUEVC死亡比例在直接和间接接触培养中均低于健康对照组(均 P<0.001),分泌颗粒酶B水平低于健康对照组( P<0.001)。抑制颗粒酶B后CD14 +单核细胞诱导HUVEC死亡比例降低( P=0.011)。IL-35刺激CD14 +单核细胞后,其诱导HUVEC死亡比例和颗粒酶B分泌水平降低(均 P<0.001)。 结论:慢性心力衰竭患者血IL-35表达升高,IL-35可通过抑制颗粒酶B分泌诱导CD14 +单核细胞功能不全,进而促进心力衰竭疾病进程。
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编辑人员丨4天前
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白细胞介素6对人脐静脉血管内皮细胞-间质细胞转化的作用
编辑人员丨4天前
目的:观察白细胞介素6(IL-6)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表型和功能的影响,探索IL-6在内皮-间充质转化(EndMT)过程中的作用。方法:采用实验研究方法。取产妇行分娩手术后弃用的新鲜正常胎儿脐带,分离培养原代细胞的第2天在倒置相差显微镜下观察细胞形态;免疫荧光法鉴定第4代细胞是否为HUVEC后,取2批第3~5代HUVEC,用于后续实验。将第1批细胞按随机数字表法(下同)分为6组:空白对照组、5 ng/mL IL-6组、10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组、100 ng/mL IL-6组,将第2批细胞分为4组:空白对照组、10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组;空白对照组仅加入完全培养液,其余各组细胞还加入相应终质量浓度的IL-6。第1批细胞,分组培养后72 h,倒置相差显微镜下观察6组HUVEC形态;免疫荧光法检测6组HUVEC凝血因子Ⅷ和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的阳性表达,并计算双阳性细胞数占凝血因子Ⅷ阳性细胞数的比值(以下简称双阳性细胞数的比值),样本数为6;实时荧光定量反转录PCR法检测6组HUVEC 血管内皮钙黏蛋白和α-SMA蛋白的mRNA表达量,样本数为3。第2批细胞,分组培养后72 h,蛋白质印迹法检测4组HUVEC 血管内皮钙黏蛋白、α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达量,样本数为3。对数据行单因素方差分析、Bonferroni校正。结果:原代分离培养的第2天细胞呈短梭形或多边形,免疫荧光法鉴定第4代细胞为HUVEC。第1批细胞,分组培养后72 h,6组细胞随IL-6浓度的逐渐增加,其形态向长梭形变化,细胞间连接减少或消失、间隙变大。分组培养后72 h,与空白对照组双阳性细胞数的比值相比,25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组、100 ng/mL IL-6组显著增高( P<0.01);与5 ng/mL IL-6组双阳性细胞数的比值相比,25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组显著升高( P<0.01);与10 ng/mL IL-6组双阳性细胞数的比值相比,50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组显著升高( P<0.01);100 ng/mL IL-6组双阳性细胞数的比值均显著高于25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组( P<0.01)。分组培养后72 h,与空白对照组细胞血管内皮钙黏蛋白的mRNA表达量比,25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组明显下降( P<0.05或 P<0.01);与5 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的mRNA表达量比较,50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组均明显下降( P<0.01);与10 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的mRNA表达量比较,50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组明显下降( P<0.01);与25 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白mRNA的表达量比较,50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组明显下降( P<0.01)。分组培养后72 h,5 ng/mL IL-6组、10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组、100 ng/mL IL-6组细胞 α-SMA的 mRNA表达水平显著高于空白对照组( P<0.05或 P<0.01)。第2批细胞分组培养后72 h,与空白对照组细胞血管内皮钙黏蛋白的蛋白表达量1.391±0.026比较,10 ng/mL IL-6组(1.185±0.063)、25 ng/mL IL-6组(0.717±0.078)、50 ng/mL IL-6组(0.293±0.064)显著降低( P<0.05);与10 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的蛋白表达量比较,25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著降低( P<0.01);与25 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的蛋白表达量比较,50 ng/mL IL-6组显著降低( P<0.01)。分组培养后72 h,与空白对照组细胞α-SMA的蛋白表达量比较,10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著升高( P<0.01);与10 ng/mL IL-6组细胞α-SMA的蛋白表达量比较,25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著增加( P<0.01)。分组培养后72 h,与空白对照组细胞Ⅰ型胶原的蛋白表达量比较,25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著增加( P<0.05)。 结论:IL-6作用于HUVEC后,细胞的表型和功能呈浓度依赖性表现为间质细胞的特征。炎症因子可促进EndMT进程,成为调控组织纤维化机制的重要因子之一。
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编辑人员丨4天前
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基于血管化机制构建萎缩型骨不连类器官芯片与初步实验研究
编辑人员丨4天前
目的:构建基于血管化机制的骨不连类器官芯片,并探讨无菌性骨不连发生机制。方法:设计半开放微流控芯片,实现人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal cells,BMSC)、人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast 1,HFL1)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)共培养,建立三维器官芯片体系。设置HFL1与HUVEC不同比例与BMSC共培养,分为对照组(HFL1∶HUVEC=1∶1)、纤维化组(HFL1∶HUVEC=3∶1)与血管化组(HFL1∶HUVEC=1∶3)。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、茜素红(alizarin red)染色观察BMSC成骨分化情况,qPCR分析成骨标志基因 SP7、 RUNX2、 ALPL、 BGLAP及血管化相关基因 KDR、 VWF转录情况,Western blot检测成骨标志蛋白RUNX2和ALP表达水平。 结果:BMSC、HFL1和HUVEC共培养体系中BMSC正常生长且出现明显生物矿化行为,血管内皮细胞能够形成有序血管结构,证实体系构建成功。相较对照组,纤维化组BMSC成骨分化下降趋势不明显,矿化标志基因 ALPL和 BGLAP相对表达量为0.55±0.19、0.42±0.27,差异均有统计学意义( P<0.05);血管化组基因 KDR和 VWF下调,相对表达量为0.49±0.17、0.49±0.21,差异均有统计学意义( P<0.05)。相较对照组,血管化组BMSC成骨分化基因 SP7、 RUNX2、 ALPL和 BGLAP上调,相对表达量分别为2.91±0.52、3.83±1.87、3.22±1.29和5.21±1.46,差异均有统计学意义( P<0.05);血管化基因 KDR、 VWF上调,相对表达为8.24±2.84、5.32±1.67,差异均有统计学意义( P<0.05)。Western blot结果表明RUNX2、ALP在血管化组中表达增加,纤维化组中表达减少。 结论:骨不连类器官芯片能够部分模拟骨不连局部微环境,纤维化可能导致骨形成能力和血管化水平显著下降,是无菌性骨不连发生的潜在重要原因。
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编辑人员丨4天前
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重复温热刺激对脂多糖作用后人脐静脉内皮细胞的细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的影响
编辑人员丨4天前
目的:观察重复温热刺激对炎症状态下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)状态及其功能的影响。方法:将培养好的HUVECs分成空白组、模型组、温热刺激5次组(5次组)、温热刺激9次组(9次组)和温热刺激13次组(13次组),分别接种至五个相同培养条件的培养皿中。空白组为正常HUVECs,不予任何刺激;模型组加入脂多糖(LPS)作为炎症状态模型对照;5次组、9次组和13次组均先进行重复温热刺激,将恒温箱调至43 ℃,将5次组、9次组和13次组放入其中,持续温热刺激4 min后取出,置于自然环境静置1 min后进行重复温热刺激,3组均接受对应次数的温热刺激。5组HUVECs9(空白组入组后即刻,模型组、5次组、9次组和13次组均于加入LPS后置于37 ℃、5% CO 2的恒温细胞培养箱中培养1 h)均采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞活力,免疫荧光检测核因子-κB(NF-κB)的表达,酶联免疫吸附剂测定ELISA法检测5组HUVECs黏附分子ICAM-1、VCAM-1的水平。 结果:干预后,模型组、5次组和13次组细胞活力的OD值显著低于空白组,差异均有统计学意义( P<0.05),9次组细胞活力的OD值明显高于模型组、5次组和13次组,差异均有统计学意义( P<0.05)。干预后,模型组、5次组、9次组和13次组的NF-κB表达量与空白组比较,差异均有统计学意义( P<0.05)。干预后,9次组NF-κB表达与模型组比较,差异有统计学意义( P<0.05)。干预后,模型组ICAM-1和VCAM-1的OD值显著增加,5次组、9次组和13次组ICAM-1和VCAM-1的OD值却显著下降,与空白组比较,差异均有统计学意义( P<0.05);5次组、9次组、13次组的ICAM-1和VCAM-1的OD值与模型组比较,差异均有统计学意义( P<0.05)。干预后,9次组ICAM-1的OD值为(43.00±12.96),与5次组的(205.89±10.56)和13次组的(109.87±8.86)比较,差异亦均有统计学意义( P<0.05)。 结论:重复温热刺激既可以保护炎症状态下HUVECs,也可降低炎症状态下HUVECs的黏附分子的表达。
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编辑人员丨4天前
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七叶皂苷钠可通过上调水通道蛋白-4的表达抑制脂多糖诱导的血管内皮炎症损伤
编辑人员丨4天前
目的:探讨七叶皂苷钠(SA)对脂多糖(LPS)诱导的血管内皮损伤致炎症作用及机制。方法:IMDM培养基(含10%胎牛血清)体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测0.4、1.6和6.4 μg/ml的SA对HUVEC的毒性,采用2.5 μg/ml和作用时间为6 h的LPS构建炎症损伤细胞模型。实验分组为空白组、模型组(2.5 μg/ml LPS)、低剂量组(2.5 μg/ml LPS+0.4 μg/ml SA)、中剂量组(2.5 μg/ml LPS+1.6 μg/ml SA)和高剂量组(2.5 μg/ml LPS+6.4 μg/ml SA)。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞白细胞介素(IL)-6的表达水平;实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞中水通道蛋白-4(AQP4)的mRNA表达量;蛋白质印迹法(Western blot)和免疫荧光检测各组细胞中AQP4蛋白表达量。两组间比较采用非成对 t检验,多组间比较采用单因素方差分析。 结果:CCK-8检测结果表明,0.4、1.6和6.4 μg/ml的SA作用6 h后的细胞活性百分数与空白组比较,差异无统计学意义(91.867±3.758、93.695±4.638、95.838±5.558比100.000±0.000, F=2.946, P>0.05)。IL-6的ELISA检测结果显示,低、中、高剂量组中IL-6的相对表达量均低于模型组(1.224±0.017、1.119±0.155和1.009±0.012比1.281±0.075, F=5.673, P<0.05);RT-qPCR结果显示,低、中、高剂量组中AQP4 mRNA的相对表达量均高于模型组(0.770±0.013、0.854±0.014和0.895±0.014比0.713±0.015, F=102.237, P<0.01);Western blot结果显示,低、中、高剂量组中AQP4蛋白相对表达量均高于模型组(0.758±0.084、0.774±0.079和0.925±0.033比0.668±0.132, F=4.283, P<0.05)。 结论:SA能抑制LPS诱导的HUVEC损伤及炎性因子表达,其机制很可能与上调细胞内AQP4表达有关。
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编辑人员丨4天前
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微小RNA-30a通过诱导血管内皮间质化促进下肢动脉硬化闭塞症血管内膜增生
编辑人员丨4天前
目的:探讨微小RNA(miRNA,miR)-30a通过诱导血管内皮细胞间质化(EndMT),促进血管内膜增生,影响下肢动脉硬化闭塞症(ASO)进程。方法:苏木精-伊红染色法(HE)检测ASO病变动脉形态、内膜中膜厚度;免疫荧光检测EndMT标志物表达。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs),构建EndMT细胞模型。将体外培养的HUVECs分为转染miR阴性对照(miR-NC组)和转染miR模拟物(miR-30a组)。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测EndMT标志物表达。细胞增殖实验检测HUVECs(EndMT)增殖能力、小室细胞迁移实验、划痕实验检测其迁移能力。采用GraphPad Prism 7进行统计学分析, t检验分析实验结果。 结果:ASO动脉内膜增生且呈间质化改变[内膜厚度,对照组(178.40±29.61) μm,ASO (422.10±39.47) μm, t=4.940, P<0.01, n=6;中膜厚度,对照组 (315.80±48.46) μm,ASO (656.80±43.91) μm, t=5.200, P<0.01, n=6],差异有统计学意义,miR-30a在HUVECs(EndMT)和ASO内膜中高表达,miR-30a表达上调能够抑制HUVECs的内皮标志物表达,同时促进其间质标志物表达[CD31,对照:3.535±0.116,miR-30a:1.360±0.185, t=9.966, P<0.01, n=3;人血管内皮钙黏蛋白(VE-Cadherin),对照:2.453±0.075,miR-30a:0.793±0.106, t=12.830, P<0.01, n=3;α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),对照:0.792±0.121,miR-30a:6.296±0.380, t=13.820, P<0.01, n=3;Ⅰ型胶原(COL1),对照:0.2413±0.063,miR-30a:2.859±0.142, t=16.840, P<0.01, n=3],差异有统计学意义,并促进HUVECs(EndMT)的增殖迁移能力[细胞迁移率,对照:(50.160±1.210)%,miR-30a:(68.560±1.918)%, t=8.115, P<0.01, n=6],差异有统计学意义。 结论:miR-30a在ASO增生内膜中表达上调,miR-30a能够诱导内皮细胞间质化,增强其增殖迁移能力,导致ASO内膜增生、促进ASO病情进展。
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编辑人员丨4天前
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含人脐血来源富血小板血浆的三维生物打印墨水在裸鼠全层皮肤缺损治疗中的应用
编辑人员丨4天前
目的:探讨含人脐血来源富血小板血浆(HUCB-PRP)的海藻酸钠-明胶(AG)生物墨水(称为HUCB-PRP-AG生物墨水)的可打印性能和细胞相容性,及该生物墨水的三维打印组织治疗裸鼠全层皮肤缺损创面的效果。方法:采用实验研究方法。制备含体积分数2.5%、5.0%、10.0%HUCB-PRP的HUCB-PRP-AG生物墨水,分别命名为1P-AG、2P-AG、4P-AG。取AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG,观察室温下外观,采用旋转流变仪检测黏度、储能模量和损耗模量。利用以上4种生物墨水分别进行三维生物打印并观察打印组织外观(后续使用交联后打印组织),将4种打印组织分别与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在Transwell小室内用HUVEC专用培养基共培养24 h,采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖水平(样本数为3);将4种打印组织分别用DMEM培养基培养12、24、48 h,进行干燥称重并计算降解率(样本数为3);将1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织分别用磷酸盐缓冲液培养0.5、24.0、48.0 h,采用酶联免疫吸附测定法检测培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的表达(样本数为5)。取16只6~8周龄雌性BALB/c-NU裸鼠建立背部全层皮肤缺损创面模型,分为创面仅覆盖医用水胶体敷料的常规对照组和另予HUCB-PRP滴加的HUCB-PRP组、AG打印组织覆盖的AG组、4P-AG打印组织覆盖的4P-AG组(每组4只),观察每组3只裸鼠伤后4、8、14 d创面愈合情况并计算创面愈合率;取每组剩余裸鼠伤后8 d创面组织,行苏木精-伊红染色后观察组织病理学改变,行免疫组织化学染色后观察CD31阳性新生血管情况。对数据行重复测量方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。结果:在室温下,AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG均呈半透明液态;AG为淡黄色,1P-AG、2P-AG、4P-AG均为淡红色但颜色依次逐渐加深。在温度10 ℃和剪切率0.1~10.0 s -1范围内,AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG的黏度均随着剪切率的增加而减小;在温度10 ℃和角频率1~100 rad/s范围内,4种生物墨水的储能模量均大于损耗模量。4种生物墨水打印组织的分辨率与形态均相近。与1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平分别为0.885±0.030、1.126±0.032、1.156±0.045,均明显高于与AG打印组织共培养的HUVEC的0.712±0.019( P<0.01);与2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平均明显高于与1P-AG打印组织共培养的HUVEC( P<0.01)。1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织培养12、24、48 h的降解率均明显高于AG打印组织( P<0.01);2P-AG、4P-AG打印组织培养24、48 h的降解率均明显高于1P-AG打印组织( P<0.01);4P-AG打印组织培养12 h的降解率明显高于1P-AG打印组织( P<0.01),培养24、48 h的降解率均明显高于2P-AG打印组织( P<0.01)。培养0.5、24.0、48.0 h,2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显高于1P-AG打印组织( P<0.01),1P-AG和2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显低于4P-AG打印组织( P<0.01)。常规对照组与HUCB-PRP组裸鼠伤后8 d创面较伤后4 d干燥且缩小,HUCB-PRP组裸鼠伤后14 d创面较常规对照组缩小且无结痂;AG组、4P-AG组裸鼠伤后4 d创面上打印组织明显降解且创面无明显渗出,伤后8 d创面明显上皮化且缩小,伤后14 d创面无结痂;4P-AG组裸鼠伤后14 d创面完全上皮化。与常规对照组比较,AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率明显降低( P<0.05),HUCB-PRP组、4P-AG组裸鼠伤后各时间点及AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高( P<0.01);与HUCB-PRP组比较,AG组裸鼠伤后4、8 d及4P-AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率均明显降低( P<0.01),AG组裸鼠伤后14 d及4P-AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高( P<0.01);4P-AG组裸鼠伤后各时间点创面愈合率均明显高于AG组( P<0.01)。伤后8 d,常规对照组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管,HUCB-PRP组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、丰富新生微血管以及较多CD31阳性新生血管,AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管,4P-AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、大量新生微血管以及大量CD31阳性新生血管。 结论:HUCB-PRP-AG生物墨水具备良好的可打印性能和细胞相容性,其三维打印组织可促进裸鼠全层皮肤缺损创面血管化,加速创面愈合。
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编辑人员丨4天前
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雌激素受体β激动剂对高糖作用下人脐静脉内皮细胞迁移和氧化应激的影响及其机制
编辑人员丨4天前
目的:探讨雌激素受体β(ERβ)激动剂对高糖作用下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移和氧化应激的影响及相关机制。方法:采用实验研究方法。将HUVEC常规培养传代,取对数生长期细胞进行后续实验。将细胞按随机数字表法分为3组,正常对照组采用含5.5 mmol/L D-葡萄糖的RPMI 1640细胞培养基(下同)培养,单纯高糖组采用仅含25.0 mmol/L D-葡萄糖的细胞培养基培养,高糖+二芳基丙腈(DPN)组采用含25.0 mmol/L D-葡萄糖+10 μmol/L DPN的细胞培养基培养。采用划痕试验检测划痕后24 h 3组细胞迁移率,荧光探针法检测培养5 d 3组细胞内活性氧水平(以红色荧光强度表示),蛋白质印迹法检测培养5 d 3组细胞内血管内皮生长因子(VEGF)及超氧化物歧化酶2(SOD2)的蛋白表达。以上每个检测均取细胞同前行相同分组及相应培养,每个指标检测每组细胞样本数均为5。对数据行单因素方差分析、LSD- t检验。 结果:划痕后24 h,单纯高糖组细胞迁移率[(36±5)%]明显低于正常对照组和高糖+DPN组[(76±4)%、(65±5)%, t=14.511、9.603, P<0.01],高糖+DPN组细胞迁移率明显低于正常对照组( t=3.943, P<0.01)。培养5 d,单纯高糖组细胞内活性氧水平(1.81±0.12)明显高于正常对照组、高糖+DPN组(1.00±0.14、0.91±0.15, t=9.679、10.549, P<0.01),高糖+DPN组细胞内活性氧水平与正常对照组相近( t=1.031, P>0.05)。培养5 d,单纯高糖组细胞内VEGF和SOD2蛋白表达均明显低于正常对照组( t=14.175、13.787, P<0.01)和高糖+DPN组( t=6.321、17.750, P<0.01);高糖+DPN组VEGF蛋白表达明显低于正常对照组( t=7.206, P<0.01),SOD2蛋白表达明显高于正常对照组( t=2.890, P<0.05)。 结论:激活ERβ可通过促进VEGF和SOD2的表达,明显改善高糖对HUVEC迁移的抑制,缓解高糖诱导的氧化应激损伤。
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编辑人员丨4天前
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牙周炎症环境中内皮细胞焦亡现象的体内外研究初探
编辑人员丨4天前
目的:通过体内外模型观察牙周炎局部组织内皮细胞在炎症环境下是否发生焦亡,为探究牙周炎发病机制提供实验依据。方法:根据牙周病2018年新分类标准收集无全身疾病、牙周健康者及Ⅲ~Ⅳ期C级牙周炎患者的牙龈组织,免疫组化染色检测牙龈组织中焦亡标志性蛋白消皮素D(GSDMD)的表达水平及分布情况;每组通过结扎3只小鼠上颌第二磨牙2周建立牙周炎模型(结扎组),使用显微CT(micro-CT)检测小鼠牙槽骨吸收情况(以不做结扎处理的小鼠作为对照组);使用免疫荧光染色对健康及炎症小鼠牙龈组织中血管内皮细胞血小板内皮细胞黏附分子(CD31)与GSDMD共定位进行定量分析;体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别以质量浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L牙龈卟啉单胞菌(Pg)脂多糖(LPS)联合腺苷三磷酸(ATP)处理HUVECs,同期设置0 mg/L Pg-LPS组为对照组。使用扫描电镜观察 HUVECs形态,蛋白质印迹法检测GSDMD的N端结构域(GSDMD-N)蛋白表达,细胞免疫荧光染色检测GSDMD蛋白表达及分布,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测HUVECs的增殖能力,碘化丙啶(PI)染色检测HUVECs细胞膜的完整性。结果:免疫组化结果显示,牙周炎患者牙龈组织中GSDMD主要分布于血管周围,且表达水平较健康组织显著升高;micro-CT结果显示,结扎组小鼠上颌第二磨牙周围牙槽骨吸收较对照组小鼠显著增多( t=8.88, P<0.001);免疫荧光染色结果显示,结扎组小鼠牙龈组织中血管内皮细胞GSDMD与CD31存在明显的共定位;扫描电镜结果显示,在不同浓度Pg-LPS联合ATP模拟的炎症环境中,HUVECs细胞膜上出现不同大小的孔洞,呈现典型的细胞焦亡形态,其中2.5 mg/L Pg-LPS+ATP组细胞膜上孔洞最多且扩张融合,细胞有裂解死亡的趋势。蛋白质印迹法结果显示,2.5和5.0 mg/L Pg-LPS+ATP组焦亡标志性蛋白GSDMD-N表达显著高于对照组( F=3.86, P<0.01);细胞免疫荧光结果显示,2.5 mg/L Pg-LPS+ATP组较对照组GSDMD平均荧光强度升高最显著( F=35.25, P<0.001)。CCK-8结果显示,0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 mg/L Pg-LPS+ATP组细胞增殖相对值(分别为0.52±0.07、0.57±0.10、0.58±0.04、0.55±0.04和0.61±0.03)均显著低于对照组(1.00±0.02)( F=39.95, P<0.001)。PI染色结果显示,PI阳性细胞数占比在2.5 mg/L Pg-LPS+ATP组最高[(56.07±3.22)%]( F=88.24, P<0.001)。 结论:牙周炎症环境中内皮细胞发生明显的焦亡现象,提示内皮细胞焦亡可能是造成牙周炎发生的重要致病因素。
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编辑人员丨4天前