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基于胚胎干细胞模型的Cry1Ab蛋白发育毒性
编辑人员丨2天前
目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性.方法:设置 Cry1Ab 蛋白 7 个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为阳性对照,以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)为溶剂对照,分别处理小鼠胚胎干细胞D3(embryonic stem cell line D3,ES-D3)和小鼠成纤维细胞3T3.通过CCK-8法检测细胞活性,计算受试物对于不同细胞的增殖半抑制浓度(50%inhibition concentration of growth and viability,IC50).设置Cry1Ab 蛋白 5 个剂量组(125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),设置溶剂对照(PBS),同时以 5-FU 为受试物进行模型验证,分别处理细胞后,通过拟胚胎体(embryonic bodies,EBs)培养法诱导ES-D3分化出心肌细胞;镜下观察EBs生长情况并测量其第3天和第5天的直径,观察并记录同批次EBs分化出搏动心肌细胞的比例,计算受试物的心肌分化半抑制浓度(50%inhibition concentration of differentiation,ID50),根据发育毒性判别函数对受试物的胚胎发育毒性进行分类;收集培养终点的EBs样本,进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative po-lymerase chain reaction,qPCR),检测心肌分化相关标志物(Oct3/4、GATA-4、Nkx2.5 和 β-MHC)的 mRNA 表达情况.结果:5-FU 的 IC50,3T3为 46.37 μg/L,IC50,ES为 32.67 μg/L,ID50,ES为 21.28 μg/L,根据判别函数结果将 5-FU 分类为强胚胎毒性物质.不同浓度的Cry1Ab蛋白处理组的3T3细胞和ES-D3细胞活性与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05).与对照组相比,Cry1Ab蛋白处理组分化第3天和第5天的EBs直径差异无统计学意义(P>0.05),EBs形态也未见明显差异;不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的心肌分化率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).5-FU使β-MHC、Nkx2.5和GATA-4的mRNA表达水平降低(P<0.05),且具有剂量依赖趋势(P<0.05),而与细胞多能性相关的标志物Oct3/4 mRNA表达水平则呈升高趋势(P<0.05);Cry1Ab蛋白处理组的成熟心肌标志物β-MHC、心肌早期分化标志物Nkx2.5和GATA-4、多能性相关标志物Oct3/4的mRNA表达水平与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05).结论:本实验模型中未观察到31.25-2 000.00 μg/L的Cry1Ab蛋白具有发育毒性.
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编辑人员丨2天前
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多系分化持续应激细胞保护肠上皮细胞间紧密连接蛋白研究
编辑人员丨2天前
目的:观察大鼠多系分化持续应激(Muse)细胞对肠上皮细胞间紧密连接结构的保护作用。方法:贴壁筛选法自大鼠(6只,购自中国食品药品检定院)股骨内分离大骨髓间充质干细胞(BMMSCs),长时间胰蛋白酶孵育法(LTi)自BMMSCs中分离大鼠Muse细胞,流式细胞术标记如白细胞分化抗原(CD)29、CD34、CD90等及特异阶段胚胎抗原-3(SSEA-3)抗体;免疫组织化学法标记Nanog同框蛋白(NANOG)等抗体,定向诱导分化后标记α-甲胎蛋白(AFP)等鉴定其多能分化能力;重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)建立体外肠上皮细胞损伤损伤模型;与Muse细胞共培养后检测细胞增殖能力及桥接蛋白-1(ZO-1)的表达水平及形态,组间比较采用 t检验。 结果:LTi后,大鼠BMMSCs中(2.57±0.57)%能够形成特征性的Muse细胞簇;流式细胞术结果表明,Muse细胞保留了BMMSCs表面分子特征,SSEA-3的阳性细胞比例[(73.2±1.4)%]显著高于BMMSCs[(2.3±0.3)%];免疫荧光实验表明,培养的Muse细胞阳性表达NANOG等多能分化标记,定向诱导分化后分别能够表达AFP等分化标记;Muse细胞与TNF-α炎症损伤的肠上皮细胞共培养后,其增殖细胞比例[(40.06±1.04)%]高于损伤[(23.10±2.05)%]组的细胞( t=12.79, P<0.05)及ZO-1蛋白的相对表达水平(0.55±0.03、0.27±0.01, t=13.03, P<0.05)。 结论:大鼠Muse细胞具有更加理想的保护炎症损伤肠上皮细胞紧密连接结构的作用。
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编辑人员丨2天前
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诱导多能干细胞在遗传性疾病研究中的应用
编辑人员丨2天前
疾病细胞模型是了解疾病发病机制以及筛选治疗药物的重要工具之一。从活体组织或者体液分离获取的原代细胞与患者基因型相同,是构建疾病细胞模型的重要细胞来源之一。尽管原代细胞具有诸多的优点,但是原代细胞分离费时费力且难以在体外培养扩增。干细胞具有持续增殖以及分化成其他细胞类群的潜能,相比于原代细胞,其在疾病细胞模型的构建更具有潜力。根据干细胞的来源不同,可将其分为成体干细胞和胚胎干细胞。目前已有胚胎干细胞用于构建疾病细胞模型的相关报道,但是该项技术涉及的伦理道德问题相对复杂,其发展前景并不理想。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)技术的出现解决了胚胎干细胞引起的人伦道德问题,为疾病细胞模型的构建提供了新方法。本文主要对诱导多能干细胞在神经退行性疾病、心律失常以及石骨症等人类遗传性疾病研究中的应用进展进行综述。
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编辑人员丨2天前
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单胚胎移植周期临床结局的影响因素分析
编辑人员丨2天前
目的:探讨影响体外受精-胚胎移植( in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)中单胚胎移植(single embryo transfer,SET)妊娠结局的因素。 方法:回顾性队列分析南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心2013年9月1日至2019年12月31日期间行SET共2734个周期的患者资料,根据胚胎移植时机的不同,分为第3日(day 3,D3)移植组(D3组)、第4日(day 4,D4)移植组(D4组)、第5日(day 5,D5)移植组(D5组)、第6日(day 6,D6)移植组(D6组)。分析对比患者不同年龄段、不同移植时机、不同胚胎评分的SET临床妊娠情况。结果:SET周期总临床妊娠率为39.8%(1098/2734),总活产率为30.5%(842/2734)。D3组、D4组、D5组、D6组的临床妊娠率分别为33.3%(264/793)、36.4%(142/390)、52.5%(492/937)、32.6%(200/614),活产率为25.6%(203/793)、30.5%(119/390)、40.9%(383/937)、22.3%(137/614),组间比较差异均有统计学意义( P均<0.001)。D3组形态学评分8-细胞I级、7-细胞I级、8-细胞II级的胚胎总临床妊娠率[41.7%(207/496)]和总活产率[32.1%(159/496)]均高于其他非优质卵裂期胚胎[19.2%(57/297), P<0.001;14.8%(441/297), P<0.001];D4组发生融合(融合期及早期囊胚)的胚胎的临床妊娠率[40.4%(134/332)]和活产率[34.0%(113/332)]均高于未发生融合的胚胎[13.8%(8/58), P<0.001;10.3%(113/332), P=0.001];对于发育缓慢的囊胚,将其培养至D6囊胚移植和在D5移植2期囊胚的临床妊娠率[32.6%(200/614)比30.6%(22/72)]和活产率[22.3%(137/614)比27.8%(20/72)]相比差异均无统计学意义( P均>0.05)。 结论:选择D5优质囊胚和D4融合期以上的桑椹胚进行单胚胎移植能在获得最佳妊娠结局的同时降低多胎妊娠发生率;对于整体D5发育缓慢的胚胎,继续培养至D6完全扩张囊胚再行移植,可能是一种改善妊娠结局的策略;对于卵裂期胚胎,采用8-细胞I级、7-细胞I级和8-细胞II级的优质胚胎移植标准更能确保D3单胚胎移植的成功率,获得满意的妊娠结局。
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编辑人员丨2天前
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从受精卵到囊胚期胚胎在体外培养发育过程中的乳酸代谢
编辑人员丨2天前
体外受精-胚胎移植( in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)是将精子和卵子在体外受精结合,并在体外进行胚胎培养发育至卵裂期或囊胚期胚胎,再移植到子宫内的过程。通常把受精卵到着床前囊胚期的发育过程称之为“胚胎着床前发育”。一般认为,人的胚胎着床前发育是靠卵母细胞蓄积的蛋白和mRNA发育至8-细胞期,然后开始激活胚胎自体基因进一步发育到囊胚期。由此可见,IVF技术治疗不孕不育的重要环节之一是着床前胚胎体外培养。体外培养液的成分会直接影响着床前胚胎发育和临床治疗结局。其中,乳酸可能在受精卵早期分裂发育过程中起了相对重要作用。本文对受精卵到囊胚期胚胎着床前体外培养液的发展过程和培养液中的乳酸成分对胚胎着床前发育的影响进行概述。同时,对培养液中乳酸成分来源的乳酸盐原料进行简单的介绍。
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编辑人员丨2天前
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肌肽对小鼠卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响
编辑人员丨2天前
目的:探讨肌肽对小鼠卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响。方法:获取小鼠卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COC),分别用含10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L肌肽的体外成熟培养液培养18 h,不含肌肽的培养液设为对照组。根据卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚形成率确定作用的最优浓度。通过检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、总谷胱甘肽(total glutathione,T-GSH)含量、皮质颗粒分布、线粒体分布和线粒体拷贝数进一步验证肌肽的作用。结果:肌肽浓度为100 μmol/L时,卵母细胞成熟率[69.23%(135/195)]、卵裂率[66.06%(72/109)]和囊胚形成率[48.61%(35/72)]最高,与对照组[44.44%(84/189)、38.67%(29/75)、20.69%(6/29)]相比,差异具有统计学意义( P<0.001、 P<0.001 、P=0.010),故选定100 μmol/L作为肌肽作用的最优浓度。对照组卵母细胞中的ROS和T-GSH水平为100 μmol/L肌肽组的2.04倍和0.64倍,差异具有统计学意义(均 P<0.001)。100 μmol/L肌肽组的皮质颗粒Ⅲ级的比例显著高于对照组( P<0.001)。对照组卵母细胞的线粒体均匀分布在胞质中,100 μmol/L肌肽组的线粒体聚集在胞质中央区域,且荧光强度高于对照组( P=0.040)。100 μmol/L肌肽组的线粒体拷贝数是对照组的1.72倍,差异具有统计学意义( P<0.001)。 结论:肌肽能够有效改善未成熟卵母细胞的氧化应激,促进小鼠卵母细胞的体外成熟和胚胎发育。
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编辑人员丨2天前
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蛋白PTEN通过调节子宫内膜腔上皮细胞极性影响胚胎着床
编辑人员丨2天前
目的:探讨人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)对子宫内膜腔上皮细胞极性的调控及对胚胎着床的影响。方法:通过实时荧光定量PCR、Western blotting、细胞免疫荧光实验比较非容受态子宫内膜腔上皮细胞HEC-1A与容受态子宫内膜腔上皮细胞RL95-2之间PTEN的表达及定位差异;PTEN干扰质粒转染HEC-1A细胞,检测紧密连接相关蛋白质表达水平,透射电子显微镜检测紧密连接结构,Transwell实验检测细胞运动能力,与绒毛膜癌细胞JAR共培养检测HEC-1A细胞与JAR细胞之间的黏附水平;向体外培养的HEC-1A细胞分别加入二甲基亚砜、17β-雌二醇、孕酮、17β-雌二醇+孕酮,检测卵巢激素对PTEN表达的影响。结果:相较HEC-1A细胞,RL95-2细胞 PTEN基因及蛋白质表达水平均显著降低( P均=0.003);PTEN主要定位于RL95-2细胞核,而在HEC-1A细胞中,PTEN主要定位于细胞质;与质粒载体对照组相比,敲降 PTEN基因后,HEC-1A细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-4表达水平显著降低( P<0.001, P=0.038, P<0.001),细胞间紧密连接长度降低( P=0.046),迁移与侵袭能力增强( P均<0.001),与JAR细胞之间黏附率增强( P=0.016);与空白对照组(二甲基亚砜组)相比,17β-雌二醇组、孕酮组及17β-雌二醇+孕酮组的PTEN蛋白表达水平均显著降低( P均<0.001),17β-雌二醇+孕酮组的PTEN蛋白表达水平显著低于17β-雌二醇组和孕酮组( P均=0.001),孕酮组与雌二醇组的PTEN蛋白表达水平差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:不同容受状态的子宫内膜细胞PTEN表达存在差异,雌二醇和孕酮可能通过抑制PTEN在子宫内膜的表达,进一步调控子宫内膜上皮细胞间紧密连接结构及细胞极性,从而增强子宫内膜容受性。
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编辑人员丨2天前
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时差成像培养系统对小鼠胚胎发育潜能及组蛋白修饰影响的研究
编辑人员丨2天前
目的:评估时差成像培养系统(time-lapse imaging,TLI)对小鼠胚胎发育潜能及组蛋白表观修饰的影响。方法:选择SPF级雌性ICR小鼠,促排卵后取成熟M Ⅱ卵子进行体外受精( in vitro fertilization,IVF),获取成功受精的合子,分别在TLI和常规培养体系(standard incubators,SI)中进行体外培养,记录两组胚胎的2-细胞率、4-细胞率、8-细胞率、桑葚胚率、囊胚率和孵出率。通过Hoechst、OCT4及CDX2抗体进行免疫荧光染色,分别统计囊胚细胞总数、内细胞团数和滋养外胚层细胞数。两组囊胚移植入第2.5天代孕母鼠子宫,统计植入率及活胎率。通过对组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)、组蛋白H3第9位赖氨酸二甲基化(H3K9me2)和组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)的免疫荧光染色,评估两组胚胎组蛋白表观修饰情况。 结果:TLI组和SI组的早期胚胎发育情况、内细胞团和滋养外胚层细胞数、植入率和活胎率比较差异均无统计学意义(均 P>0.05)。两组囊胚的组蛋白H3K4me3、H3K9me2和H3K9ac的表达水平差异均无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:利用TLI体外培养不会影响胚胎的发育潜能以及组蛋白修饰。
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编辑人员丨2天前
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多囊卵巢综合征患者卵泡液的拉曼光谱分析及其对小鼠卵母细胞体外成熟的影响
编辑人员丨2天前
目的:探究多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)患者与非PCOS患者卵泡液中的差异性代谢物及其对小鼠卵母细胞体外成熟( in vitro maturation,IVM)和体外受精( in vitro fertilization,IVF)胚胎发育的影响。 方法:本研究的临床资料采取回顾性队列研究的研究方法获取;动物实验采取随机对照试验。收集2019年6月至2020年6月期间在上海集爱遗传与不育诊疗中心第一次接受IVF或卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)周期的女性患者的卵泡液。根据是否为PCOS患者,分为PCOS组( n=71)和非PCOS组( n=70),回顾性分析两组患者的临床资料,并利用深度学习的拉曼光谱分析技术检测两组患者卵泡液的代谢谱差异。后续进行实验性研究,在PCOS患者和非PCOS患者卵泡液中进行小鼠GV期卵母细胞IVM培养,收集两组成熟的鼠卵母细胞进行IVF,进一步探讨卵泡液中差异性代谢物对鼠卵成熟及胚胎发育的影响。 结果:PCOS组患者卵母细胞成熟率[82.19%(886/1 078)]和受精第3天的有效胚胎率[51.30%(553/1 078)]显著低于非PCOS组[85.85%(625/728), P=0.038;53.30%(388/728), P=0.042],两组患者的累积临床妊娠率和累积活产率差异均无统计学意义(均 P>0.05)。PCOS患者和非PCOS患者卵泡液之间存在差异性拉曼代谢光谱。两组间特征性拉曼位移主要集中在600~1 000 cm -1、1 168 cm -1、1 344 cm -1、1 440 cm -1、1 504 cm -1、1 632 cm -1、1 664 cm -1。拉曼特征位移数据库显示,两组卵泡液样本的差异代谢物主要集中蛋白质、脂质、游离核酸、葡萄糖、胆固醇、类胡萝卜素和氨基酸等物质。利用两组卵泡液行鼠卵IVM,PCOS卵泡液组的鼠卵MⅡ率[49.04%(77/157)]较非PCOS组更低[65.07%(95/146), P=0.005],利用小鼠MⅡ卵进行IVF,PCOS卵泡液组卵裂率[46.75%(36/77)]显著低于非PCOS组[63.16%(60/95), P=0.031],而两组囊胚率差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:PCOS患者卵泡液存在差异性拉曼代谢光谱,其差异性代谢物可能导致卵母细胞成熟障碍,并进一步影响IVF胚胎的发育,拉曼光谱为PCOS诊断和代谢组学的差异物分析提供了简便有效的方法。
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编辑人员丨2天前
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MiR-146a-5p对脂多糖诱导的小鼠胚胎吸收和胎鼠发育不良的改善作用及其机制初探
编辑人员丨2天前
目的:观察外源性miR-146a-5p对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠胚胎吸收和胎鼠发育不良的改善作用,并初步探讨其作用机制。方法:①将36只成年雌鼠与雄鼠交配,分别于交配前(D0/未孕)、孕第0.5天(day 0.5,D0.5,即见栓当日)、孕第4.5天(day 4.5,D4.5)、孕第7.5天(day 7.5,D7.5)、孕第9.5天(day 9.5,D9.5)和孕第13.5天(day 13.5,D13.5)收集小鼠子宫组织,通过实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)和Western blotting检测不同妊娠期小鼠子宫组织中miR-146a-5p及其靶基因TRAF6蛋白的表达水平;②对孕D7.5小鼠腹腔分别注射生理盐水(对照,记为COL组)、LPS 250 μg/kg(记为LPS250组)、LPS合并尾静脉注射10 nmol miR-146a-5p无关序列(negative control,NC,记为LPS250+NC组)、LPS合并尾静脉注射10 nmol miR-146a-5p激动剂(miR-146a-5p agomir,记为LPS250+miR-146a-5p agomir组),孕第8.5天(day 8.5,D8.5)对小鼠宫内总胚胎数和吸收胚胎数进行计量分析,通过qPCR和Western blotting分别检测子宫组织中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)mRNA和TRAF6蛋白表达水平;③将LPS剂量减为50 μg/kg后,将孕D7.5小鼠分为2组,每组3只:一组腹腔注射100 μL LPS(50 μg/kg),同时鼠尾静脉注射10 nmol 的无关序列,记为LPS50+NC组;另一组行腹腔注射100 μL LPS(50 μg/kg),同时鼠尾静脉注射10 nmol 的miR-146a-5p agomir,记为 LPS50+miR-146a-5p agomir组,孕第16.5天(day 16.5,D16.5)对小鼠宫内总胎数/胚胎数、吸收胚胎数、存活胎数及存活胎鼠重量和胎盘重量进行计量分析;④分离培养原代小鼠骨髓源性巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM),利用LPS刺激诱导其M1极化,再瞬时转染miR-146a-5p模拟物(miR-146a-5p mimics)或其NC片段后,通过qPCR和Western blotting分别检测细胞中 TNFα mRNA和pSTAT1蛋白表达水平。 结果:miR-146a-5p在孕D7.5、D9.5和D13.5小鼠子宫植入部位的表达水平显著高于非植入部位( P=0.013、 P=0.012、 P=0.003),TRAF6蛋白在D13.5植入部位的表达水平显著低于非植入部位( P=0.012)。对孕D7.5小鼠腹腔注射250 μg/kg LPS后,孕D8.5时LPS250组的胚胎吸收率为43.13%±3.31%,显著高于COL组(0%, P=0.002),而LPS250+miR-146a-5p agomir组的胚胎吸收率(13.50%±0.87%)显著低于LPS250+NC组(59.33%±4.04%, P=0.001)。当对孕D7.5小鼠腹腔注射低剂量LPS(50 μg/kg)后,D16.5时LPS50+miR-146a-5p agomir组存活胎鼠重量[(0.29±0.09)g]及胎盘重量[(0.06±0.02)g]均显著高于LPS50+NC组[(0.46±0.06)g, P<0.001;(0.07±0.02)g, P=0.021],两组间吸收胚胎数及胚胎吸收率差异均无统计学意义(均 P>0.05)。与转染NC的BMDM细胞相比,转染miR-146a-5p mimics的BMDM细胞中,pSTAT1蛋白和 TNFα mRNA的表达水平都显著下调( P=0.012、 P=0.039)。 结论:miR-146a-5p在小鼠胚胎植入后期及胎盘发育期母-胎界面的表达水平显著增高,外源性miR-146a-5p能有效改善LPS诱导的小鼠胚胎吸收和胎鼠发育不良,miR-146a-5p能抑制小鼠巨噬细胞的M1极化活性,提示miR-146a-5p可能通过抑制小鼠母-胎界面巨噬细胞的M1极化而保障妊娠的正常建立和维持。
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编辑人员丨2天前