-
NCOA4介导的铁自噬在小鼠肠缺血再灌注损伤中的作用及其与铁死亡的关系
编辑人员丨6天前
目的:评价核受体辅激活因子4 (NCOA4)介导的铁自噬在小鼠肠缺血再灌注损伤中的作用及其与铁死亡的关系。方法:SPF级健康雄性C57BL/6小鼠30只,8~10周龄,体重21~25 g,采用随机数字表法分为5组( n=6):假手术组(Sham组)、肠缺血再灌注组(I/R组)、肠缺血再灌注+NCOA4沉默组(I/R+NCOA4 shRNA组)、肠缺血再灌注+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(I/R+3-MA)和肠缺血再灌注+NCOA4沉默+自噬激活剂雷帕霉素组(I/R+NCOA4 shRNA+RAPA组)。采用夹闭肠系膜上动脉45 min再灌注的方法制备小鼠肠缺血再灌注损伤模型。于造模前2周,I/R+NCOA4 shRNA组和I/R+NCOA4 shRNA+RAPA组尾静脉注射AAV-NCOA4-shRNA 1×10 11 vp,Sham组、I/R组和I/R+3-MA组注射AAV shCtrl(腺病毒对照) 1×10 11 vp。于造模前7 d I/R+NCOA4 sh-RNA+RAPA组腹腔注射雷帕霉素4 mg/kg,1次/d;于造模前1 h I/R+3-MA组腹腔注射3-甲基腺嘌呤10 mg/kg。于再灌注2 h时,处死取肠组织,行Chiu评分,采用比色法检测MDA、谷胱甘肽(GSH)和Fe 2+含量,ELISA法检测TNF-α和IL-1β含量,Western blot法检测NCOA4、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、铁蛋白重链1(FTH1)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)表达水平,计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。 结果:与Sham组比较,I/R组肠组织Chiu评分、MDA、Fe 2+、TNF-α和IL-1β含量升高,GSH含量降低,NCOA4和ACSL4表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,GPX4和FTH1表达下调( P<0.05);与I/R组比较,I/R+NCOA4 shRNA组和I/R+3-MA组肠组织Chiu评分、MDA、Fe 2+、TNF-α和IL-1β含量降低,GSH含量升高,I/R+NCOA4 shRNA组肠组织NCOA4和ACSL4表达下调,GPX4和FTH1表达上调( P<0.05),I/R+3-MA组ACSL4表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,GPX4和FTH1表达上调( P<0.05);I/R+NCOA4 shRNA组与I/R+NCOA4 shRNA+RAPA组上述指标比较差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:NCOA4介导的铁自噬可促进铁死亡,参与小鼠肠缺血再灌注损伤的病理生理机制。
...不再出现此类内容
编辑人员丨6天前
-
褪黑素预处理对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝缺血再灌注损伤的影响
编辑人员丨6天前
目的:评价褪黑素预处理对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝缺血再灌注损伤的影响。方法:SPF级雄性SD大鼠48只,10~12周龄,体重200~230 g,采用随机数字表法分为4组( n=12):对照组(Con组)、NAFLD组、NAFLD+肝缺血再灌注组(NAFLD+HIR组)和NAFLD+肝缺血再灌注+褪黑素预处理组(NAFLD+HIR+MT组)。NAFLD组、NAFLD+HIR组及NAFLD+HIR+MT组连续8周喂养高脂高糖饲料(含10%糖、10%脂肪),其余组大鼠喂养普通饲料,自由饮水。NAFLD+HIR+MT组造模前连续2周每天予以褪黑素10 mg/kg灌胃预处理。采用夹闭肝动脉和门静脉20 min后开放5 min,再次夹闭20 min后恢复灌注的方法制备肝缺血再灌注损伤模型。再灌注6 h时收集下腔静脉血标本和肝组织,检测血清胰岛素、血糖、游离脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、ALT、AST和铁蛋白水平,计算胰岛素抵抗指数。采用ELISA法检测肝组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、ROS、SOD和Fe 2+的水平,HE染色后光镜下观察肝组织病理学结果,采用Western blot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、溶血卵磷脂酰基转移酶3(LPCAT3)、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达水平。 结果:与Con组相比,NAFLD组血清FFA、TG、ALT、AST、铁蛋白水平和胰岛素抵抗指数升高,肝组织ROS和Fe 2+水平升高,GSH-Px和SOD水平降低,ACSL4和LPCAT3表达上调,Nrf2和GPX4表达下调( P<0.05);与NAFLD组相比,NAFLD+HIR组血清FFA、TG、ALT、AST、铁蛋白水平和胰岛素抵抗指数升高,ROS和Fe 2+水平降低,GSH-Px和SOD水平升高,ACSL4和LPCAT3表达上调,Nrf2和GPX4表达下调( P<0.05);与NAFLD+HIR组相比,NAFLD+HIR+MT组血清FFA、TG、ALT、AST、铁蛋白水平和胰岛素抵抗指数降低,肝组织ROS和Fe 2+水平降低,GSH-Px和SOD水平升高,ACSL4和LPCAT3表达下调,Nrf2和GPX4表达上调( P<0.05)。 结论:褪黑素预处理可减轻NAFLD大鼠肝缺血再灌注损伤,其机制可能与激活Nrf2信号通路,减轻脂质过氧化反应,抑制铁死亡有关。
...不再出现此类内容
编辑人员丨6天前
-
新型冠状病毒相关急性脑病22例临床及短期预后特征
编辑人员丨6天前
目的:总结新型冠状病毒感染相关急性脑病的临床及短期预后特征。方法:回顾性队列研究。收集2022年12月至2023年1月于首都医科大学附属北京儿童医院神经内科住院的22例新型冠状病毒相关急性脑病患儿的临床资料、影像学资料及短期预后。按照可能的临床病理机制及影像学特征分为细胞因子风暴组、兴奋毒性组及不能分类的脑病组,对各组患儿的临床特点进行描述性分析。根据末次随访儿童校正版Rankin量表(mRS)评分,分为预后良好组(≤2分)和预后不良组(>2分),两组比较采用Mann-Whitney U秩和检验或Fisher确切概率法。 结果:22例患儿中男10例、女12例,起病年龄为3.3(1.7,8.6)岁。11例(50%)有异常既往史,4例有异常家族史。患儿均以发热起病,21例(95%)在发热24 h内出现神经系统症状。首发神经系统症状中抽搐17例,意识障碍5例。病程中脑病表现22例,抽搐20例,言语障碍14例,不自主运动8例,共济失调3例。细胞因子风暴组3例均为急性坏死性脑病(ANE);兴奋毒性组9例,8例为急性脑病伴双相发作及后期弥散减低(AESD),1例为偏侧惊厥偏瘫综合征;不能分类的脑病组10例。天冬氨酸转氨酶升高9例,丙氨酸转氨酶升高4例,血糖升高3例,D二聚体升高3例;5例检测血清铁蛋白3例升高,9例行血和脑脊液神经丝轻链蛋白检测5例升高,18例检测血细胞因子7例升高,8例检测脑脊液细胞因子7例升高。18例头颅影像学异常,3例ANE均显示对称性、多灶性病灶,8例AESD均存在“亮树征”。22例患儿急性期均给予对症治疗及免疫治疗(免疫球蛋白或糖皮质激素),其中1例ANE予托珠单抗治疗。22例患儿随访50(43,53)d,预后良好组10例,预后不良组12例,两组在流行病学、临床表现、生化指标、启动免疫治疗的病程等方面差异均无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:新型冠状病毒也是引起急性脑病的重要病原体,AESD和ANE为常见急性脑病综合征,早期甄别发热、抽搐、意识障碍的患儿并积极治疗是改善其预后的关键。
...不再出现此类内容
编辑人员丨6天前
-
棕榈酸诱导小鼠胰岛 β 细胞株MIN6细胞发生铁死亡的研究
编辑人员丨6天前
目的:探讨棕榈酸(PA)是否可诱导小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞发生铁死亡。方法:将小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞分为正常对照组、PA组(1.0 mmol/L)、PA+凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)组(5 μmol/L)、PA+铁死亡抑制剂(Fer-1)组(5 μmol/L)、PA+坏死抑制剂(Nec-1)组(5 μmol/L),每组设置3个平行组。采用CCK8法检测细胞存活率,电镜观察细胞超微结构改变,FerroOrange试剂盒检测细胞内Fe 2+水平,丙二醛(MDA)试剂盒检测MDA水平,流式法检测活性氧(ROS)水平,实时荧光定量PCR法检测凋亡基因半胱氨酸蛋白酶3( caspase3)、坏死基因受体结合丝氨酸苏氨酸激酶3( RIPK3)、铁死亡相关基因长链脂酰辅酶A合成酶4( ACSL4)、花生四烯酸-15-脂加氧酶( ALOX15)、前列腺素内过氧化物合酶2( Ptgs2)、铁蛋白重链( FTH)、铁蛋白轻链( FTL)和谷胱甘肽过氧化物酶4( GPX4)的mRNA表达水平,Western blotting法检测活化型caspase3(cleaved caspase3)、RIPK3、ACSL4、ALOX15和Ptgs2的蛋白表达水平。两组间比较采用 t检验。 结果:与PA组相比,PA+Z-VAD-FMK组、PA+Fer-1组和PA+Nec-1组MIN6的存活率均更高( P<0.01)。PA组MIN6细胞电镜下可见凋亡、坏死、及铁死亡相关的形态学特征。与对照组相比,PA组MIN6细胞内Fe 2+相对荧光强度、MDA水平、总ROS均更高; caspase3、 RIPK3、 ACSL4、 Ptgs2、 ALOX15的mRNA相对表达量均更高, FTH和 GPX4的mRNA相对表达量均更低;cleaved caspase3、RIPK3、ACSL4、ALOX15和Ptgs2的蛋白相对表达量均更高(均 P<0.01)。与PA组相比,PA+Fer-1组Fe 2+相对荧光强度、MDA水平、总ROS均更低; ACSL4、 Ptgs2、 ALOX15的mRNA相对表达量均更低, FTH和 GPX4的mRNA相对表达量均更高;ACSL4、ALOX15和Ptgs2的蛋白相对表达量均更低(均 P<0.01)。 结论:PA可诱导小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞发生铁死亡。
...不再出现此类内容
编辑人员丨6天前
-
小鼠脑缺血再灌注早期cGAS-STING信号通路与铁自噬的关系
编辑人员丨6天前
目的:评价小鼠脑缺血再灌注早期环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)-干扰素基因刺激蛋白(STING)信号通路与铁自噬的关系。方法:清洁级健康雄性C57BL/6小鼠24只,6~8周龄,体重21~25 g,采用随机数字表法分为4组( n=6):假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注损伤(CIRI)组、CIRI+cGAS抑制剂组(CIRI+RU组)和CIRI+cGAS抑制剂+过表达核受体辅激活因子4(NCOA4)组(CIRI+RU+LV-NCOA4组)。采用大脑中动脉栓塞(MCAO)法制备CIRI模型。CIRI+RU组于再灌注前10 min腹腔注射cGAS抑制剂5 mg/kg;CIRI+RU+LV-NCOA4组于MCAO前7 d脑室注射NCOA4过表达慢病毒(1×10 9 TU/ml)2 μl,其余操作同CIRI+RU组。再灌注6 h后行神经功能缺陷评分,随后处死小鼠并取脑,TTC法检测脑梗死体积,TBA法检测MDA含量,WST-1法检测SOD活性,Western blot法检测cGAS、STING、NCOA4、铁蛋白和微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)的表达。 结果:与Sham组相比,CIRI组神经功能缺陷评分和脑梗死体积增加,脑组织SOD活性降低,MDA含量升高,cGAS、STING、NCOA4和LC3B表达上调,铁蛋白表达下调( P<0.05);与CIRI组相比,CIRI+RU组神经功能缺陷评分和脑梗死体积减小,脑组织SOD活性升高,MDA含量降低,cGAS、STING、NCOA4和LC3B表达下调,铁蛋白表达上调( P<0.05);与CIRI+RU组相比,CIRI+RU+LV-NCOA4组神经功能缺陷评分和脑梗死体积增加,脑组织SOD活性降低,MDA含量升高,NCOA4和LC3B表达上调,铁蛋白表达下调( P<0.05),cGAS和STING表达差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:cGAS-STING信号通路可促进铁自噬的过度激活,增强氧化应激,进而诱发小鼠早期CIRI。
...不再出现此类内容
编辑人员丨6天前
-
氢气对慢性脑缺血大鼠脑组织铁代谢相关蛋白表达的影响
编辑人员丨6天前
目的:探讨氢气对慢性脑缺血(CCI)大鼠脑组织铁代谢相关蛋白表达的影响。方法:健康成年雄性Wistar大鼠36只,体重300~400 g,采用随机数字表法分为3组( n=12):假手术组(Sham组)、CCI组、富氢盐水组(H组)。采用改良的双侧颈总动脉永久性结扎法制备大鼠CCI模型。CCI组及H组在大鼠建模4周后每天固定时点,分别腹腔注射生理盐水或富氢盐水10 ml/kg,1次/d,持续2周。CCI建模第6周时,处死大鼠,取脑组织,免疫组化法检测特异性神经元核蛋白(NeuN)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX-4)的表达,采用改良Perl染色法检测病灶脑组织铁沉积量,采用比色法测定MDA、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)水平,采用ELISA法检测4-羟基壬烯酸(4-HNE)水平,采用流式细胞术检测神经细胞ROS水平,采用RT-PCR法检测转铁蛋白(TF)、转铁蛋白受体1(TFR1)、铁蛋白轻链(FTL)、铁蛋白重链-1(FTH1)、二价金属离子转运体(DMT1)、铁反应元件结合蛋白2(IREB2)的mRNA表达。 结果:与Sham组比较,CCI组及H组海马CA1区NeuN、GPX-4染色阳性细胞百分比、GSH、GSH-px水平降低,铁染色阳性细胞百分比、MDA、4-HNE及神经细胞ROS水平升高,FTL mRNA、FTH1 mRNA表达下调,TF mRNA、TFR1 mRNA、DMT1 mRNA和IREB2 mRNA表达上调( P<0.05);与CCI组比较,H组海马CA1区NeuN、GPX-4染色阳性细胞百分比、GSH和GSH-px水平升高,铁染色阳性细胞百分比、MDA、4-HNE及神经细胞ROS水平降低,FTL mRNA、FTH1 mRNA表达上调,TF mRNA、TFR1 mRNA、DMT1 mRNA和IREB2 mRNA表达下调( P<0.05)。 结论:氢气对CCI大鼠可产生神经保护作用,机制可能与其调控CCI后铁代谢及转运相关蛋白的表达,减轻神经细胞铁超载,进而抑制氧化应激有关。
...不再出现此类内容
编辑人员丨6天前
-
维生素D补充对糖尿病模型大鼠胰岛铁过载和β细胞凋亡的影响
编辑人员丨2023/8/5
目的 探讨维生素D(VD)补充对糖尿病模型(ZDF)大鼠胰岛铁过载和β细胞凋亡的影响.方法 雄性5~6w Zucker瘦型(ZL)大鼠为对照组(ZL+VD.Def),ZDF大鼠按照体质量随机分为模型VD缺乏(ZDF+VD.Def)及模型VD补充(ZDF+VD,8μg/kg·bw)2组,喂养7w.应用HE染色、胰岛素免疫组化、TUNEL荧光观察胰岛损伤、β 细胞数量及凋亡情况,用增强普鲁士蓝、蛋白质免疫印迹观察胰腺铁沉积及caspase3和铁代谢相关蛋白水平.结果 与ZL+VD.Def组相比,ZDF+VD.Def组胰岛损伤严重,β细胞数量减少,凋亡增加,胰腺c-caspase3蛋白水平增加(P<0.01);与ZDF+VD.Def组相比,ZDF+VD组胰岛损伤减轻,β 细胞数量增加,凋亡减少,胰腺c-caspase3蛋白水平降低(P<0.01);与ZL+VD.Def组比较,ZDF+VD.Def组胰岛存在明显铁沉积,胰腺铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)、铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)、二价金属离子转运体1(divalent metal ion transporter 1,DMT1)、锌铁调控转运蛋白14(zrt/IRT-like protein 14,ZIP14)蛋白水平分别增加至23(P<0.001)、3.7(P<0.01)、2.1(P<0.01)、4.2(P<0.001)倍,转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TfR1)蛋白水平降低38%(P<0.05),转铁蛋白受体2(transferrin receptor 2,TfR2)蛋白水平无明显改变;与ZDF+VD.Def组比较,ZDF+VD组胰岛铁沉积明显减轻,胰腺FTL、FTH、DMT1、ZIP14蛋白水平分别降低76%(P<0.01)、54%(P<0.05)、62%(P<0.001)、71%(P<0.001),TfR1和TfR2蛋白水平无明显改变.结论 VD可能通过调节铁代谢相关蛋白,缓解ZDF大鼠胰岛铁过载,减少β细胞凋亡.
...不再出现此类内容
编辑人员丨2023/8/5
-
The mechanism by which hyperbaric oxygen treatment alleviates spinal cord injury:genome-wide transcriptome analysis
编辑人员丨2023/8/5
Accumulating studies have demonstrated that hyperbaric oxygen(HBO)treatment alleviates spinal cord injury(SCI).However,the underlying mechanism by which HBO alleviates SCI remains to be elucidated.In this study,we performed genome-wide transcriptional profiling of the spinal cord between SCI mice and mice that received HBO treatment by high-throughput RNA sequencing at 1 week after SCI.We also compared genome-wide transcriptional profiles from SCI mice and sham-operated mice.We found 76 differentially co-expressed genes in sham-operated mice,SCI mice,and HBO-treated SCI mice.Using Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis,we identified the biological characteristics of these differentially expressed genes from the perspectives of cell component,biological process,and molecular function.We also found enriched functional pathways including ferroptosis,calcium signaling pathway,serotonergic synapse,hypoxia-inducible factor-1 signaling pathway,cholinergic synapse,and neuroactive ligand-receptor interaction.We performed quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and validated that HBO treatment decreased the expression of Hspb1(heat shock protein beta 1),Hmox1(heme oxygenase 1),Ftl1(ferritin light polypeptide 1),Tnc(tenascin C)and Igfbp3(insulin-like growth factor binding protein 3)and increased the expression of Slc5o7(solute carrier family 5 choline transporter member 7)after SCI.These results revealed the genome-wide transcriptional profile of the injured spinal cord after HBO treatment.Our findings contribute to a better understanding of the mechanism by which HBO treats SCI and may provide new targets for SCI intervention.
...不再出现此类内容
编辑人员丨2023/8/5
-
DL-3-n-butylphthalide alleviates motor disturbance by suppressing ferroptosis in a rat model of Parkinson's disease
编辑人员丨2023/8/5
DL-3-n-butylphthalide (NBP)—a compound isolated from Apium graveolens seeds—is protective against brain ischemia via various mechanisms in humans and has been approved for treatment of acute ischemic stroke. NBP has shown recent potential as a treatment for Parkinson's disease. However, the underlying mechanism of action of NBP remains poorly understood. In this study, we established a rat model of Parkinson's disease by intraperitoneal injection of rotenone for 28 successive days, followed by intragastric injection of NBP for 14–28 days. We found that NBP greatly alleviated rotenone-induced motor disturbance in the rat model of Parkinson's disease, inhibited loss of dopaminergic neurons and aggregation of α-synuclein, and reduced iron deposition in the substantia nigra and iron content in serum. These changes were achieved by alterations in the expression of the iron metabolism-related proteins transferrin receptor, ferritin light chain, and transferrin 1. NBP also inhibited oxidative stress in the substantia nigra and protected mitochondria in the rat model of Parkinson's disease. Our findings suggest that NBP alleviates motor disturbance by inhibition of iron deposition, oxidative stress, and ferroptosis in the substantia nigra.
cystine/glutamate antiporter solute carrier family 7 member 11 DL-3-n-butylphthalide ferritin light chain ferroportin 1...不再出现此类内容
编辑人员丨2023/8/5
-
褪黑素通过下调SLC7A11表达来诱导胶质瘤细胞SH-SYSY铁死亡的机制研究
编辑人员丨2023/8/5
目的 探讨褪黑素(Melatonin,MT)通过下调溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7member 11,SLC7A11)表达对胶质瘤细胞(Glioma cell,SH-SYSY)铁死亡的影响.方法 使用不同水平的MT处理人胶质瘤SH-SY5Y细胞,采用细胞计数试剂盒-8(Cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞活性,进而选择合适的MT水平;实验分组为二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)组(加入常规培养基)、MT组(加入1 mmol/L的MT)、凋亡抑制剂氟甲基酮(Z-VAD-FMK)+MT组(加入1 mmol/L的MT和20μmol/L的凋亡抑制剂Z-VAD-FMK)、坏死性凋亡抑制剂Necrosulfonamide(Nec-1)+MT组(加入1 mmol/L的MT和1μmol/L的坏死性凋亡抑制剂Nec-1)、自噬抑制剂Chloroquine+M T组(加入1 mmol/L的M T和5 mmol/L的自噬抑制剂Chloroquine)、特异性铁死亡抑制剂Deferoxamine(DFO)对照组(加入20μmol/L的特异性铁死亡抑制剂DFO)及DFO+M T组(加入1 mmol/L的M T和20μmol/L DFO);CCK-8法检测细胞活性;碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色法评价细胞死亡情况;Phen Green SK荧光指示剂法测定细胞Fe2+水平;活性氧(Reactive oxygen,ROS)检测试剂盒测定细胞总ROS水平;C11-BODIPY染色法检测细胞脂质活性氧(Lip-id reactive oxygen species,lipid ROS)水平;总谷胱甘肽(Glutathione,GSH)检测试剂盒测定细胞GSH水平;Western blot法检测细胞铁蛋白重链(Ferritin heavy polypeptide,FT H)、铁蛋白轻链(Ferritin light chain,FTL)、膜铁转运蛋白(Ferroportin,FPN)、转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1,TFR1)和SLC7A11蛋白表达水平;实时定量反转录聚合酶链反应(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞SLC7A11 mRNA表达水平.结果 随着MT水平的增高,SH-SY5Y细胞活性逐渐降低(P<0.05),由于1 mmol/L处理的SH-SY5Y细胞活性最低,因此选择1 mmol/L MT诱导细胞.与DMSO组比较,DFO+MT组SH-SY5Y细胞活性显著升高(P<0.05),而Z-VAD-FMK+MT组、Nec-1+MT组和Chloroquine+MT组SH-SY5Y细胞活性无明显差异(P>0.05).此外,MT能显著提高SH-SY5Y细胞中Fe2+水平、ROS和lipid ROS水平以及TFR1蛋白表达水平,降低GSH水平和FPN1,FTH,FTL蛋白及SLC7A11基因表达水平,促进细胞铁死亡(P<0.05),而DFO则能逆转M T对上述指标水平的影响(P<0.05),但DFO本身对上述指标水平无明显影响(P>0.05).结论 MT可能通过下调SLC7A11表达来提高细胞内F e2+水平,进而诱导胶质瘤细胞铁死亡.
...不再出现此类内容
编辑人员丨2023/8/5